První experimentální údaje zaměřené specificky na úlohu NO v plicní hypertenzi pocházejí ze začátku devadesátých let. Tehdy laboratoř Dr. Adnota publikovala svůj nález, že perfundované plíce, izolované z chronicky hypoxických potkanů 11, mají sníženou reaktivitu na látky, které působí vazodilataci uvolněním endogenního NO [30]. Dinh-Xuan a spolupracovníci [31] zjistili, že in vitro reaktivita na NO-dependentní vazodilatancia je snížená ve velkých plicních tepnách hypoxických pacientů s terminální plicní hypertenzí. Obě studie byly interpretovány v tom smyslu, že chronická hypoxie působí plicní hypertenzi tím, že inhibuje vysokou bazální syntézu vazodilatačního NO v plicních cévách. Záhy se však začaly kupit důkazy (včetně našich) proti existenci fyziologicky významné bazální plicní syntézy NO (kap. 4.5). Proto, a vzhledem k tomu, že reaktivita na NO-dependentní vazodilatancia je jen velmi nepřímým ukazatelem syntézy NO, jsme se rozhodli pro detailnější studium úlohy NO při chronické hypoxické plicní hypertenzi.
Nejprve jsme se rozhodli reprodukovat pokus Adnota a spol. [30]. Měřili jsme tedy vazodilataci vyvolanou substancí P v izolovaných plicích potkana prekontrahovaných analogem tromboxanu (U46619) a navíc i v plicích prekontrahovaných akutní hypoxií [192, 92, 119]. Vazodilatace vyvolaná substancí P je zprostředkována uvolněním endogenního NO [234, 39, 235, 41, 119].
V našich podmínkach byla plicní vazodilatace vyvolaná substancí P konzistentně potencována chronickou hypoxií (Obrázek 6-1) [192, 92, 119, 64]. Toto naše pozorování bylo záhy potvrzeno řadou laboratoří [114, 115, 236, 237, 238]. Navíc inspekce starších studií, provedených v době, kdy závislost použitých vazodilatancií na NO nebyla ještě známa, ukázala stejné výsledky [239, 4, 240]. Kromě toho skupina Dr. Adnota zjistila, že pacienti s plicní hypertenzí vyvolanou chronickou hypoventilací mají podobnou plicní vazodilatační odpověď na acetylcholin (NO-dependentní vazodilatancium) a na exogenní NO [241]. Schopnost plicního endotelu odpovídat na acetylcholin uvolněním NO není tedy u těchto pacientů porušena.
Důvod neshody těchto výsledků s výše zmíněnými pozorováními Adnota a spolupracovníků [30] není úplně jasný. Může snad souviset s deficitem L-argininu u jejich hypoxických potkanů [242]. Hyporeaktivita plicních cév pacientů s terminální plicní hypertenzí [31] může souviset s těžkým strukturalním poškozením cév. Navíc je známo, že NO-dependentní regulace tonu je ve velkých plicních cévách (použitých ve studii Dinh-Xuana a spol. [31]) podstatně odlišná od periferních odporových cév, nejvíce zodpovědných za celkové hemodynamické chování plic [240]. V každém připadě je zřejmé, že převaha experimentálních údajů svědčí proti redukované NO-dependentní plicní vazodilataci při plicní hypertenzi.
Jak již bylo zmíněno, vypovídací schopnost tohoto typu pokusu o úloze NO při plicní hypertenzi je omezená, zejména proto, že změněná reaktivita může být důsledkem nejen změněné schopnosti syntetizovat NO, ale i změněného počtu či citlivosti receptorů pro studovaná vazodilatancia či změněné reaktivity cévního hladkého svalu na NO. Proto jsme se rozhodli studovat úlohu NO několika dalšími přístupy, jak je popsáno v následujícím textu. Na základě našich zjištění popsaných v tomto oddíle bylo naší pracovní hypotézou, že syntéza NO v plicních cévách není při chronické hypoxické plicní hypertenzi omezena, naopak je možné, že je potencována.
Prvním krokem byl pokus založený na následující úvaze: Je-li chronická hypoxická plicní hypertenze důsledkem nedostatku endogenního NO, pak by mělo být možné vyvolat plicní hypertenzi chronickou farmakologickou inhibicí NO syntázy v normoxii. Studie, při níž byla měřena plicní hemodynamika u potkanů, jimž byl po 3 týdny do vody na pití přidáván L-NAME [92], je podrobněji popsána v kapitole 4.1.
Výsledky jednoznačně ukázaly zcela rozdílný stav plicní cirkulace při chronické inhibici NO syntázy a při chronické hypoxii (Obrázek 6-2). Na rozdíl od chronické hypoxie nezvýšila dlouhodobá inhibice NO syntázy tlak v plícnici, váhu pravé komory, ani muskularizaci periferních plicních cév. Chronická aplikace L-NAME posunula vztah mezi perfúzním tlakem a průtokem v izolovaných plicích k poněkud vyšším tlakům, avšak podstatně méně než chronická hypoxie. Individuální hodnoty srdečního výdeje a tlaku v plícnici ležely na regresních přímkách, které byly u kontrol a po chronické inhibici NO syntázy prakticky totožné. Hodnoty naměřené u chronicky hypoxických potkanů naproti tomu ležely na regresní přímce, která byla oproti kontrolám posunuta k tlakům vyšším asi o 15 mmHg [obr. 5 v ref. 65].
Jak bylo diskutováno výše, tyto naše výsledky byly nepřímo potvrzeny zjištěním, že pacienti s chronickým renálním selháním mají značně zvýšené plasmatické hladiny endogenních inhibitorů NO syntázy (L-NMMA a NG,NG-dimetylarginin) [167], a přesto nemívají plicní hypertenzi častěji, než je běžné ve všeobecné populaci. Dohromady tedy tyto nálezy opravňují tvrzení, že dlouhodobá inhibice NO syntázy nevyvolává chronickou plicní hypertenzi ani u laboratorních potkanů [92], ani u lidí [167]. To je důležitým argumentem pro naše tvrzení, že chronická hypoxická plicní hypertenze není způsobena redukcí endogenní syntézy NO v plicní cirkulaci.
Jak bylo diskutováno v kap. 4.2, akutní aplikace inhibitorů NO syntázy obvykle nepůsobí významnou plicní vazokonstrikci. Pokud by platila možnost, kterou naznačila zvýšena reaktivita na NO-dependentní vazodilatancia (kap. 6.1), že totiž plicní syntéza NO je při plicní hypertenzi zvýšená, pak by plicní vazokonstrikční reaktivita na inhibitory NO syntázy měla být při chronické hypoxii zvýšená.
Testování této možnosti [119] ukázalo, že tomu tak skutečně je. U kontrolních zvířat byl L-NAME prakticky bez efektu až do dávky 5x10-5 M včetně 12. U chronicky hypoxických potkanů působily stejné dávky progresivní plicní vazokonstrikci (Obrázek 6-3).
Tyto údaje tedy potvrzují hypotézu, naznačenou zvýšenou reaktivitou na NO-dependentní vazodilatancia, že syntéza NO při chronické hypoxické plicní hypertenzi nejen není snížená, ale je zřejmě naopak zvýšená (z normální minimální urovně).
Rozhodujícím a definitivním důkazem zvýšené plicní syntézy NO při chronické plicní hypertenzi může být pouze její co možná nejpřímější měření. To bylo cílem pokusu, jehož metodika je podrobněji popsána v kapitole 4.3. Měřili jsme celkové množství NO uvolněného do perfuzátu izolovaných plic potkana během jedné hodiny [119]. Celkové množství uvolněného NO bylo měřeno jako součet NO jako takového a jeho konečného oxidačního produktu ve vodném prostředí neobsahujícím oxyhemoproteiny, NO2- [69].
Zjistili jsme [119], že celkové množství NO uvolněného do perfuzátu bylo statisticky významně vyšší u plic izolovaných z chronicky hypoxických než z normoxických potkanů, kde se statisticky významně nelišilo od nuly (Obrázek 6-4). Je důležité připomenout, že Obrázek 6-4 ukazuje akumulaci NO+ NO2- za jednu hodinu, během níž byly všechny plíce ventilovány normoxickou směsí. Výsledky tedy nejsou vysvětlitelné okamžitým působením hypoxie na tvorbu či degradaci NO během perfúze, nýbrž jsou důsledkem dlouhodobější změny aktivity NO syntázy navozené chronickou hypoxickou plicní hypertenzí před izolací plic.
Výsledky popsané v kapitole 6 (shrnuje je Tabulka 6-3) dohromady ukazují, že chronická hypoxická plicní hypertenze není NO deficientním stavem; naopak, syntéza NO v plicním oběhu je zvýšená.
Tabulka 6-3: Souhrn výsledků ukazujících zvýšenou tvorbu NO při chronické hypoxické plicní hypertenzi
| 1. | NO-dependentní plicní vazodilatace je při chronické hypoxické plicní hypertenzi potencována | |
| 2. | Chronické podávání L-NAME nesimuluje chronickou hypoxickou plicní hypertenzi |
[92]
|
| 3. | Inhibitory NO syntázy působí při chronické hypoxické plicní hypertenzi silnější plicní vazokonstrikci než v kontrolních plicích (kde je minimální) |
[119]
|
| 4. | Akumulace NO a jeho oxidačního produktu, NO2-, v perfuzátu izolovaných plic je při chronické hypoxické plicní hypertenzi zvýšená |
[119]
|
Jak bylo zmíněno a diskutováno výše (kap. 6.1), naše výsledky, ukazující zvýšenou plicní reaktivitu na NO-dependentní vazodilatancia při chronické hypoxické plicní hypertenzi (Obrázek 6-1), jsou v souladu s výsledky řady dalších laboratoří [239, 4, 240, 114, 115, 236, 237, 238], i když existují i protichůdné nálezy [30, 31]. Podobně i naše zjištění potencované vazokonstrikční odpovědi na inhibitory NO syntázy při chronické hypoxické plicní hypertenzi (Obrázek 6-3) je v souladu s nálezy jiných [113, 114, 116, 120]. Naproti tomu naše studie s chronickou inhibicí NO syntázy [92], která nesimuluje chronickou hypoxickou plicní hypertenzi (Obrázek 6-2), jsou unikátní (podobné výsledky byly publikovány pouze formou abstraktu [165, 166]). Jsou však nepřímo potvrzeny výše diskutovaným zjištěním, že pacienti s chronickým selháním ledvin mají značně zvýšené plasmatické hladiny endogenních inhibitorů NO syntázy (L-NMMA a NG,NG-dimetylarginin) [167], a přesto plicní hypertenze nepatří mezi komplikace chronického renálního selhání.
Náš závěr, že chronická hypoxická plicní hypertenze není NO deficientním stavem, a že naopak syntéza NO je při ní zvýšená, potvrdily studie exprese NO syntázy v plicích. Histochemická a imunohistochemická lokalizace NO syntázy ukázala, že enzym chybí v endotelu a hladkém svalu odporových plicních cév kontrolních potkanů, avšak je tam bohatě exprimován u potkanů s chronickou hypoxickou plicní hypertenzí [130]. Obsah mRNA pro endoteliální NO syntázu (studovaný in situ hybridizací a reverzní polymerázovou reakcí) i obsah enzymu samého (studovaný imunoblotovou analýzou) je signifikantně zvýšen v plicním homogenátu potkanů s chronickou hypoxickou plicní hypertenzí [132]. Konverze triciem značeného L-argininu na [3H]citrulin 13 v plicním homogenátu je potencována u chronicky hypoxických potkanů [130, 132]. U lidí byla popsána redukce exprese plicní endoteliální NO syntázy u pacientů s těžkou primární a sekundární plicní hypertenzi [172]. Skutečnost, že tato redukce byla tím větší, čím těžší bylo morfologické poškození cév, naznačuje, že NO syntázy může ubývat v terminálních stádiích choroby. Xue a Johns [173] ukázali na malém souboru pacientů s plicní hypertenzí hypoxického typu velmi výraznou expresi NO syntázy v endotelu odporových plicních cév.
| Předchozí kapitola |
|
4. Emery CJ, Bee D, Barer GR: Mechanical properties and reactivity of vessels in isolated perfused lungs of chronically hypoxic rats. Clin Sci 1981; 61: 569-580.
11. Hampl V, Weir EK, Archer SL: Endothelium-derived nitric oxide is less important for basal tone regulation in the pulmonary than the renal vessels of adult rat. J Vasc Med Biol 1994; 5: 22-30.
24. Weir EK, Archer SL, Rubin LJ: Pulmonary hypertension. In: Willerson JT, Cohn JN, Eds. Cardiovascular Medicine. New York, Churchill Livingstone, 1995; 1495-1523.
28. Reeves JT, Herget J: Experimental models of pulmonary hypertension. In: Weir EK, Reeves JT, Eds. Pulmonary Hypertension. Mount Kisco, Futura, 1984: 361-391.
30. Adnot S, Raffestin B, Eddahibi S, Braquet P, Chabrier P-E: Loss of endothelium-dependent relaxant activity in the pulmonary circulation of rats exposed to chronic hypoxia. J Clin Invest 1991; 87: 155-162.
31. Dinh-Xuan AT, Higenbottam TW, Clelland CA, Pepke-Zaba J, Cremona G, Butt AY, Large SR, Wells FC, Wallwork J: Impairment of endothelium-dependent pulmonary-artery relaxation in chronic obstructive lung disease. N Engl J Med 1991; 324: 1539-1547.
39. Moncada S: The 1991 Ulf von Euler lecture: The L-arginine:nitric oxide pathway. Acta Physiol Scand 1992; 145: 201-227.
41. Moncada S, Higgs A: The L-arginine-nitric oxide pathway. N Engl J Med 1993; 329: 2002-2012.
64. Hampl V, Cornfield DN, Huang J, Shultz PJ, Weir EK, Archer SL: Nitric oxide. In: Peacock AJ, Ed. Pulmonary Circulation: A Handbook for Clinicians. London, Chapman and Hall, 1996; 99-114.
65. Hampl V, Archer SL: The role of endogenous nitric oxide in acute hypoxic pulmonary vasoconstriction. In: Zapol WM, Bloch KD, Eds. Nitric Oxide and the Lung. New York, Marcel Dekker, 1997; 113-135.
69. Bush PA, Gonzalez NE, Griscavage JM, Ignarro LJ: Nitric oxide synthase from cerebellum catalyzes the formation of equimolar quantities of nitric oxide and citrulline from L-arginine. Biochem Biophys Res Commun 1992; 185: 960-966.
92. Hampl V, Archer SL, Nelson DP, Weir EK: Chronic EDRF inhibition and hypoxia: effects on pulmonary circulation and systemic blood pressure. J Appl Physiol 1993; 75: 1748-1757. (abstrakt)
113. Barer G, Emery C, Stewart A, Bee D, Howard P: Endothelial control of the pulmonary circulation in normal and chronically hypoxic rats. J Physiol 1993; 463: 1-16.
114. Oka M, Hasunuma K, Webb SA, Stelzner TJ, Rodman DM, McMurtry IF: EDRF suppresses an unidentified vasoconstrictor mechanism in hypertensive rat lungs. Am J Physiol 1993; 264: L587-L597.
115. Russ RD, Walker BR: Maintained endothelium-dependent pulmonary vasodilation following chronic hypoxia in the rat. J Appl Physiol 1993; 74: 339-344.
116. Russell P, Wright C, Kapeller K, Barer G, Howard P: Attenuation of chronic hypoxic pulmonary hypertension in rats by cyclooxygenase products and by nitric oxide. Eur Respir J 1993; 6: 1501-1506.
119. Isaacson TC, Hampl V, Weir EK, Nelson DP, Archer SL: Increased endothelium-derived nitric oxide in hypertensive pulmonary circulation of chronically hypoxic rats. J Appl Physiol 1994; 76: 933-940. (abstrakt)
120. Wanstall JC, Hughes IE, O'Donnell SR: Evidence that nitric oxide from the endothelium attenuates inherent tone in isolated pulmonary arteries from rats with hypoxic pulmonary hypertension. Br J Pharmacol 1995; 114: 109-114.
130. Xue C, Rengasamy A, Lecras TD, Koberna PA, Dailey GC, Johns RA: Distribution of NOS in normoxic vs. hypoxic rat lung: upregulation of NOS by chronic hypoxia. Am J Physiol 1994; 11: L667-L678.
132. Shaul PW, North AJ, Brannon TS, Ujiie K, Wells LB, Nisen PA, Lowenstein CJ, Snyder SH, Star RA: Prolonged in vivo hypoxia enhances nitric oxide synthase type I and type III gene expression in adult rat lung. Am J Respir Cell Mol Biol 1995; 13: 167-174.
165. Emery C: Effect of chronic oral treatment with L-nitro arginine methyl ester on hypoxic vasoconstriction in rat lung. Am Rev Respir Dis 1993; 147 (suppl.): A226.
166. Kouyoumdjian C, Adnot S, Carville C, Eddahibi S, Raffestin B: Effects of short term and long term inhibition of nitric oxide (NO) synthesis in normoxic and hypoxic rats. Am Rev Respir Dis 1993; 147 (suppl.): A494.
167. Vallance P, Leone A, Calver A, Collier J, Moncada S: Accumulation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in chronic renal failure. Lancet 1992; 339: 572-575.
172. Giaid A, Saleh D: Reduced expression of endothelial nitric oxide synthase in the lungs of patients with pulmonary hypertension. N Engl J Med 1995; 333: 214-221.
173. Xue C, Johns RA: Endothelial nitric oxide synthase in the lungs of patients with pulmonary hypertension [letter]. N Engl J Med 1995; 333: 1642-1644.
192. Isaacson T, Weir EK, Hampl V, Nelson D, Archer S: Enhanced vasoconstriction in chronic hypoxic pulmonary hypertension is not associated with reduced responsiveness to EDRF or nitric oxide. FASEB J. 1992; 6: A1177.
234. Archer SL, Kulik TJ, Chesler E, Weir EK: The effects of substance P on the preconstricted pulmonary vasculature of the anesthetized dog. Proc Soc Exp Biol Med 1986; 183: 19-27.
235. McMahon TJ, Kadowitz PJ: Analysis of responses to substance P in the pulmonary vascular bed of the cat. Am J Physiol 1993; 264: H394-H402.
236. Resta TC, Walker BR: Orally administered L-arginine does not alter right ventricular hypertrophy in chronically hypoxic rats. Am J Physiol 1994; 266: R559-R563.
237. Resta TC, Walker BR: Chronic hypoxia selectively augments endothelium-dependent pulmonary arterial vasodilation. Am J Physiol 1996; 270: H888-96.
238. Resta TC, Gonzales RJ, Dail WG, Sanders TC, Walker BR: Selective upregulation of arterial endothelial nitric oxide synthase in pulmonary hypertension. Am J Physiol 1997; 41: H806-H813.
239. Vogel JHK, Cameron D, Jamieson G: Chronic pharmacologic treatment of experimental hypoxic pulmonary hypertension. With observations on rate of change in pulmonary arterial pressure. Am Heart J 1966; 72: 50-59.
240. Orton EC, Reeves JT, Stenmark KR: Pulmonary vasodilation with structurally altered pulmonary vessels and pulmonary hypertension. J Appl Physiol 1988; 65: 2459-2467.
241. Adnot S, Kouyoumdjian C, Defouilloy C, Andrivet P, Sediame S, Herigault R, Fratacci MD: Hemodynamic and gas exchange responses to infusion of acetylcholine and inhalation of nitric oxide in patients with chronic obstructive lung disease and pulmonary hypertension. Am Rev Respir Dis 1993; 148: 310-316.
242. Eddahibi S, Adnot S, Carville C, Blouquit Y, Raffestin B: L-arginine restores endothelium-dependent relaxation in pulmonary circulation of chronically hypoxic rats. Am J Physiol 1992; 263: L194-L200.
| Předchozí kapitola |
|
11 Chronická hypoxie je nejčastěji používaným stimulem pro vyvolání chronické plicní hypertenze u laboratorních zvířat [28] a jednou z nejčastějších příčin plicní hypertenze u lidí (např. při chronické obstrukční chorobě plic) [24].
12 Vyšší dávky způsobily plicní vazokonstrikci, o níž se s ohledem na naše ostatní výsledky (zejména srovnání s perfundovanou ledvinou [11]) domníváme, že je asi projevem narůstajících nespecifických účinků L-NAME (kap. 3.2).
13 L-citrulin je vedlejším produktem NO syntázy; konverze [3H]argininu na [3H]citrulin proto měří aktivitu NO syntázy.
| Předchozí kapitola |
|
